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大肠菌群的测定
2023-12-05 20:00课程 人已围观
大肠菌群介绍
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。
大肠菌群检测方法
进入无菌室步骤
1．进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。5—1小时。
2．关灯后0•5小时后放可进入。
3．进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套
实验步骤
1，进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成）
2，准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。
3，直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml）
4，再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml）
5，再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）
6，再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液
7，更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml）
8，再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）
9，再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。）
10，把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中）
11，梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成－2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成－3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样
12，如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面）
13，取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。
14，再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方法见标准）
15，只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。
16，清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121C，0。5小时同时不能放气。
常见问题及解答
1、食品中大肠菌群的检测有两个标准三种方法，该如何选择呢？
A：依据产品标准的项目单位
若单位为CFU/g，则选择GB 4789.3-2016第二法（平板计数法）
若单位为MPN/g，则选择GB 4789.3-2016第一法（MPN计数法）
若单位为MPN/100g，则选择GB/T 4789.3-2003。
2、MPN法3个适宜的连续稀释度该怎样选择？
A：依据产品标准的项目标准值
若标准值为＜3.0MPN/g，则选择0.1g、0.01g、0.001g三个稀释度。
若标准值为≤30MPN/100g，则选择1g、0.1g、0.01g三个稀释度。
样品采集
怎样采样，才能使样品具有代表性？ 这里将样品分为两类：预包装食品和散装食品或现场制作食品
1、对于预包装食品
① 应采集相同批次、独立包装、适量件数的食品样品，每件样品的采样量应满足微生物项目检验的要求。
② 独立包装小于、等于1000g的固态食品或小于、等于1000mL的液态食品，取相同批次的包装。
③ 独立包装大于1000mL的液态食品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均质后采集适量样品，放入同一个无菌采样容器内作为一件食品样品；大于1000g的固态食品，应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品，放入同一个无菌采样容器内作为一件食品样品。
2、对于散装食品或现场制作食品
用无菌采样工具从n个不同部位现场采集样品，放入n个无菌采样容器内作为n件食品样品。每件样品的采样量应满足微生物项目检验单位的要求。
培养基制备过程容易出现问题解答
1、异常现象一：培养基不凝固
原因分析：
①制备过程中过度加热；
②低pH造成培养基酸解；
③称量不正确；
④琼脂未完全溶解；
⑤培养基成分未充分混匀。
2、异常现象二：pH不正确
原因分析：
①制备过程中过度加热；
②水质不佳；
③外部化学物质污染；
④测定pH时温度不正确；
⑤pH计未正确校准；
⑥脱水培养基质量差。
3、异常现象三：颜色异常
原因分析：
①制备过程中过度加热；
②水质不佳；
③pH不正确；
④外来污染；
⑤脱水培养基质量差。
4、异常现象四：产生沉淀
原因分析：
①制备过程中过度加热；
②水质不佳；
③脱水培养基质量差；
④pH计未正确控制。
5、异常现象五：培养基出现抑制/低的生长率
原因分析：
①制备过程中过度加热；
②脱水培养基质量差；
③水质不佳；
④使用成分不正确，如：成分称量不准，添加剂浓度不正确；
⑤制备容器或水中的有毒残留物。
6、异常现象六：选择性差
原因分析：
①制备过程中过度加热；
②脱水培养基质量差；
③配方使用不对；
④添加成分的加入不正确，例如加入添加成分时培养基过热或添加浓度错误；
⑤添加剂污染。
7、异常现象七：污染
原因分析：
①不适当的灭菌；
②无菌操作技术存在问题；
③添加剂污染。
实验过程
1、2016版平板法VRBA倾注完，待琼脂凝固后为什么需要加3-4mL的覆盖层？
A：因为大肠菌群是需氧及兼性厌氧的，再加一层琼脂相当于造就一个半厌氧环境，促进兼性厌氧菌的生长，同时抑制其他菌的生长。除此之外，还有防止菌落蔓延的作用，防止迁徙性菌落对菌落计数构成影响。例如一些变形杆菌就会有迁徙现象，从而导致菌落长成一片无法区分。在表面多覆盖一层培养基就可以避免这种情况的发生。
2、GB 4789.3-2016平板法验证菌落如何挑取？
A：分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落数。按比例挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。假如在1:10的平板上可疑大肠菌群有10个，典型大肠菌群有6个。证实实验应该按照可疑跟典型5:3的比例进行挑取，移种于BGLB肉汤管内。
结果处理
1、所有稀释度都不在计数范围内怎么办？
这种情况一般都是最低稀释度的平板都小于15CFU，这种情况就是以最低稀释度的平板菌落数乘以验证试验的比例来计算。例如10倍稀释的两个平板上菌落数分别为10、8，菌落数为10的平皿挑取10个菌落复发酵中有8个菌落产气，菌落数为8的平皿挑取8个菌落复发酵中有7个菌落产气，则计算过程是这样的：(10*8/10+8*7/8)/2*10=75CFU/g（mL）。
2、连续两个稀释度的四个平皿的菌落数都在计数范围内怎么办？
这个需要参考菌落总数检测国标里7.1.2里的公式计算。我们需要先计算每个平皿的验证后的菌落数，再代入公式计算即可。例如10倍稀释度两个平皿菌落数为120和125,100倍稀释度两个平皿的菌落数为17和16，经过复发酵验证产气的管数分别为7、8、8、8，则我们先计算每个平皿上的菌落数分别为120*7/10=84,125*8/10=100,17*8/10=13.6（我们计14），16*8/10=12.8（我们计13），然后将84、100、14、13四个数代入公式：（84+100+14+13）/（2+0.2）*10=959，结果应报告960CFU/g（mL）。
3、只有一个稀释度的一个平皿的菌落数在计数范围，其他均不在计数范围怎么办？
这样我们只需要复发酵验证这一个平皿即可，根据这一个平皿的菌落数进行报告。例如10倍稀释度两个平皿菌落数为160和142,100倍稀释度两个平皿的菌落数为12和13，则我们只需要从菌落数为142CFU的平皿里挑取10个菌落进行复发酵验证即可，假如共有7支发酵管阳性，则应计算142*7/10=99.4，结果报告99CFU/g（mL）。
细菌菌落总数检测常见误差原因分析
细菌菌落总数是微生态制剂样品检测必做的一项指标。菌落总数检测同其他检验一样，也存在检测误差。平板计数法是检测饲料中细菌总数、活酵母数、芽孢杆菌数及乳酸菌数的常用方法之一，因此，该值准确与否直接关系到微生物饲料添加剂类产品的质量好坏。微生物平板计数的通常方法为每个样品用 3个稀释度，每个稀释度常做 3个重复。但如何对平板菌落进行正确计数、3个稀释度以哪一个稀释度进行计数及微生物检测允许误差等问题，在饲料标准中并未有所规定，而这些问题与统计值的准确性密切相关。我们就实际检测芽孢杆菌工作中遇到一些菌落计数的问题，与大家进行探讨。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1样品：随机抽取微生态饲料添加剂合生素样品3份。
1.1.2 培养基：营养琼脂。
1.1.3仪器设备：磁力搅拌器，无菌培养皿，培养箱，振荡器。
1.2 试验方法
1.2.1样品的振荡时间对菌数检测的影响
选择1个样品，称取10 g，放入无菌锥形瓶内，加入90 mL无离子水，磁力搅拌分别为l0、20、30、40和60 min。
用1 mL移液枪从中吸取1 mL样品悬浊液加入到盛有9 mL去离子水的试管中，用振荡器使样品充分均匀，以此类推，制成10-1～1O-7不同稀释度的样品溶液。
平板涂布法检测菌含量：用移液枪从样品稀释液中各吸取200uL，每个样品稀释液3个重复；将平板倒置于35-37℃培养箱中培养24 h。
1.2.2 检测方法对菌数检测的影响
各个样品称取l0 g，放入无菌锥形瓶内，加入90 mL无离子水，磁力搅拌分别为40 min。并稀释成10-1～l0-7 不同稀释度的样品溶液。
倾注平板法检测菌含量：用移液枪从各个平行样品相应稀释液中各吸取1 mL，每个样品稀释液3个重复，待培养基表面干燥后，将平板倒置于35-37℃培养箱中培养24 h。
平板涂布法检测菌含量：用移液枪从各个平行样品相应稀释液中各吸取200uL涂布平板，每个样品稀释液3个重复；将平板倒置于35～37℃培养箱中培养24 h。
2结果
2.1样品的振荡时间对菌数检测结果的影响
采用细菌平板计数的方法，不同振荡时间对合生素中芽孢杆菌检出量的结果见表1。从表l中可见：不同振荡时间获得的细菌菌落数量有较大差别。总体而言，在一定时间内，随着振荡时间的延长检出有效菌含量增加，说明细菌从载体上解析需要一定的时间；当振荡时间为40 min后产品中的菌含量基本稳定。采用适当振荡时间才能更精确的显示产品中有效菌的含量。
表1 震荡时间对有效菌含量结果的影响 亿CFU／g
2.2 检测方法对菌数检测结果的影响
表2 检测方法对有效菌含量结果的影响 亿CFU／g
采用不同的检测方法，对合生素中芽孢杆菌检出量的结果见表2。从表2可见：不同方法获得的细菌菌落数量有差别，倾注平板法相较平板涂布法检测的菌含量多，但基本在20％误差范围内。平板计数法操作相对简单、快捷且影响因素较少。倾注法培养基营养分布较均匀，对部分蔓延菌落能控制，但对操作人员熟练程度要求相对较高。
3分析与讨论
3.1样品处理对结果的影响
取样时对样品取样口和取样工具要消毒，防止样品交叉污染。
3.2样品的均质处理对结果的影响
固体样品要用均质器或玻璃珠等充分均质，也可在稀释液中添加相应溶解液（如吐温80和液体石蜡等）的稀释液，以保证样品的充分均质。
测定芽孢杆菌活菌数时，不同振荡时间获得的细菌菌落数量有较大差别，因为细菌从载体上解析并均匀分散到溶液中需要一定的时间，待测样品应在振荡器上充分振荡，使得芽孢杆菌可以充分和均匀地分散到待测溶液中，避免因为菌体未完全释放而引起结果中细菌含量偏低的现象。
3.3 试验过程中操作方法的影响
加样l mL时，用1 mL的吸管并且每做一个稀释度都要换1支吸管，否则稀释度间菌落计数误差会超过10％，说明存在操作误差。用吸管向平皿里加样，平皿开口要小，吸管要直立且加样结束后，让吸头接触皿底干燥处，保证加样的体积不少。
若采取倾注平板法时，平皿加样后要及时倾注琼脂，其间隔一般不超过20 min （最好在10 min内)。以琼脂不烫手(约45℃)为宜，否则会杀灭细菌，太热也会使冷凝水过多，影响细菌的生长。加入琼脂要及时摇匀，先向一个方向旋转，然后向另一方向旋转。这样会减少菌落的集聚和连片现象。另外，用力不要过大，使琼脂不溅到皿壁和皿盖上，保证计数结果的准确。当琼脂凝固后，要及时移入培养箱倒置培养。若采用涂布平板法进行检测，放置适当时间后，则立即将平皿翻转后放置培养箱中进行培养，以避免菌落蔓延生长，难以计数。
为保证结果准确，除作琼脂的空白对照外，还要对菌落计数的全程做一对照。
3.4 菌落计数误差
菌落计数在完成培养后应立即进行，以防菌落继续生长蔓延从而影响测定结果。培养基中加入TTC（氯化三苯四氮唑)可使细菌菌落显红色，这样可与同样品颗粒和凝集物(白色)相区分，以提高菌落计数的准确性。有学者认为：100 mL培养基中加入2～3 mL的TTC可使菌落着色且不抑制细菌的生长。
菌落计数时要2个人分别用菌落计数器计数菌落总数，取2个人的平均数报告菌落总数。
一般来说，每平板含20～200个菌落的稀释度的菌含量与实际结果最接近，超过200个／平皿或小于2O个／平皿的计数结果则可能与实际存在较大差别。因此，应尽量选择20～200个／平皿的稀释度进行芽孢杆菌的计数，保证菌落计数的有效性。报告结果要遵守国标中菌落计数的方法进行。
4小结
菌落数检测的误差可能来自于多个方面。试验研究表明：除了检测环境和培养基之外，误差主要来自于样品和检验的操作过程，包括检验的准备环节。一般认为，微生物样品不能复检。但当菌落总数在标准的临界或菌落出现明显的异常时，有时重新检测还是必要的。这里所提到的重新检测是对同一批次未开封且保存的时间和温度都比较合适的样品。这样，可以通过重新检测校正误差。
